pet28a
@钟倩502：pet28a 引物大肠杆菌表达载体pet28a的通用引物有哪些? - 作业帮
扶钩17359052737…… [答案] T7正向和反向2条引物
@钟倩502：质粒电泳时3种构象移动速度比,以pet28a为例介绍,也就说说3条带大概位置, - 作业帮
扶钩17359052737…… [答案] pet28a是5369bp,电泳的时候看应该是在marker的5000之上有2-3条带,带之间距离挺近的
@钟倩502：pET - 28(a)+质粒的提取效果不好?提取量低怎么办? -
扶钩17359052737…… 最佳答案 回答者:匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> pET-28(a)+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低,所以和其他质粒相比量会少一些,你可以多摇一段时间,16-18h都没有问题. 略微提高抗生素的浓度,有助于提高拷贝数.还有就是不要用BL21等表达菌提质粒,表达菌多没有endA-突变,质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha,TOP10等菌,提取的质量也不高,因为碱裂解时会有大量的多糖干扰,质和量都不如DH5α和TOP10. 铺较高抗生素浓度的板子,重新划线,挑个大点的菌落再摇.培养时候也加大抗生素浓度.
@钟倩502：pet28a 引物 -
扶钩17359052737…… 建议你做一个双酶切看看,你的目的条带是不是成功连接上了.你的pet28a的酶切位点是哪个,是不是连接出现了问题.即使连接成功了,还有可能是你的基因需要加入诱导剂才会正常生长.该质粒上有lac调控区,你的菌需要诱导不,确认一下.
@钟倩502：为什么双酶切pet28a老切不干净 -
扶钩17359052737…… 展开全部- 1.pET28a提出来时分子量就很大,8kb左右,不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大,但双酶切后在5.5kb左右
@钟倩502：重组质粒双酶切鉴定 -
扶钩17359052737…… 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了.你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题.pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常.换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.
@钟倩502：pet29a和pet28a的区别 -
扶钩17359052737…… 理论上影响是比较大的,原核LB培养不加抗生素的话,很容易出现丢失了带有外源基因质粒的生长速度比目的菌的生长速度快得多的情况.最后的结果就是影响目的蛋白的表达量. 所以如果这个蛋白表达培养的实验是第一次做的话,建议重做窢范促既讵焕存唯担沥一遍以保证数据的准确.如果不是第一次做的话,可以对比下之前的表达数据验证下是否有影响.
@钟倩502：在原核表达蛋白时,由于用的是原核表达载体PET28a,属于卡那抗性,但忘加卡那了,这样影响大不大? -
扶钩17359052737…… 理论上影响是比较大的,原核LB培养不加抗生素的话,很容易出现丢失了带有外源基因质粒的生长速度比目的菌的生长速度...
@钟倩502：pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - 作业帮
扶钩17359052737…… [答案] 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.
@钟倩502：pet28a载体中连在目的蛋白前的标签和酶切位点有几KD? -
扶钩17359052737…… 3kd左右. 但是通常6*his带大量正电,使得跑SDS-PAGE时电泳行为异常. 所以这个3kd通过电泳是看不出来的.
扶钩17359052737…… [答案] T7正向和反向2条引物
@钟倩502：质粒电泳时3种构象移动速度比,以pet28a为例介绍,也就说说3条带大概位置, - 作业帮
扶钩17359052737…… [答案] pet28a是5369bp,电泳的时候看应该是在marker的5000之上有2-3条带,带之间距离挺近的
@钟倩502：pET - 28(a)+质粒的提取效果不好?提取量低怎么办? -
扶钩17359052737…… 最佳答案 回答者:匿名用户 时间:2009-08-28 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> pET-28(a)+质粒的拷贝数在细菌里本身就是很低,所以和其他质粒相比量会少一些,你可以多摇一段时间,16-18h都没有问题. 略微提高抗生素的浓度,有助于提高拷贝数.还有就是不要用BL21等表达菌提质粒,表达菌多没有endA-突变,质粒的完整性和保真性都不如DH5alpha,TOP10等菌,提取的质量也不高,因为碱裂解时会有大量的多糖干扰,质和量都不如DH5α和TOP10. 铺较高抗生素浓度的板子,重新划线,挑个大点的菌落再摇.培养时候也加大抗生素浓度.
@钟倩502：pet28a 引物 -
扶钩17359052737…… 建议你做一个双酶切看看,你的目的条带是不是成功连接上了.你的pet28a的酶切位点是哪个,是不是连接出现了问题.即使连接成功了,还有可能是你的基因需要加入诱导剂才会正常生长.该质粒上有lac调控区,你的菌需要诱导不,确认一下.
@钟倩502：为什么双酶切pet28a老切不干净 -
扶钩17359052737…… 展开全部- 1.pET28a提出来时分子量就很大,8kb左右,不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大,但双酶切后在5.5kb左右
@钟倩502：重组质粒双酶切鉴定 -
扶钩17359052737…… 既然你的质粒已经提出来了,那么感受态、转化等因素就不必再考虑了.你看看双酶切后载体的位置有几条带,如果是两条,那说明酶切不完全,如果是一条,那说明酶切效率没问题.pET28a分子量为5.6k,你的插入片段为500bp,如果你的质粒完全切开,载体和插入片段的摩尔比为1:1,质量比就是5.6k:0.5k,跑胶后两条带的亮度比就是10:1,所以你目的条带很淡非常正常.换句话说,你的实验一切正常,那条500bp的条带可能本来就应该那么淡.
@钟倩502：pet29a和pet28a的区别 -
扶钩17359052737…… 理论上影响是比较大的,原核LB培养不加抗生素的话,很容易出现丢失了带有外源基因质粒的生长速度比目的菌的生长速度快得多的情况.最后的结果就是影响目的蛋白的表达量. 所以如果这个蛋白表达培养的实验是第一次做的话,建议重做窢范促既讵焕存唯担沥一遍以保证数据的准确.如果不是第一次做的话,可以对比下之前的表达数据验证下是否有影响.
@钟倩502：在原核表达蛋白时,由于用的是原核表达载体PET28a,属于卡那抗性,但忘加卡那了,这样影响大不大? -
扶钩17359052737…… 理论上影响是比较大的,原核LB培养不加抗生素的话,很容易出现丢失了带有外源基因质粒的生长速度比目的菌的生长速度...
@钟倩502：pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - 作业帮
扶钩17359052737…… [答案] 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.
@钟倩502：pet28a载体中连在目的蛋白前的标签和酶切位点有几KD? -
扶钩17359052737…… 3kd左右. 但是通常6*his带大量正电,使得跑SDS-PAGE时电泳行为异常. 所以这个3kd通过电泳是看不出来的.
