蛋白诱导表达不成功
@卫康6817：蛋白表达不出来是怎么回事? -
白瑾15654465271…… 第一步:确定载体序列是否正确,启示子、终止子、读码框等; 第二步:确定操作步骤是否正确,如载体是否被污染,是否成功转化入rossetta,抗生素是否正确等; 第三步:核对目的基因序列,...
@卫康6817：为什么用IPTG诱导蛋白没表达? -
白瑾15654465271…… 质粒先测个序吧,这是基础,不然后面一切都白搭.我以前做个C端myc标签的真核表达载体,中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多.可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,表达出了类似大小的带myc标签的蛋白.而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的.
@卫康6817：怎么提高诱导表达的目的蛋白含量 -
白瑾15654465271…… 诱导表达没有目的蛋白产生原因无非两种 一是诱导条件不适合目的蛋白的表达,可通过改变培养基,温度,诱导剂等条件重新摸索出合适的诱导条件. 二是目的蛋白的菌种有问题,可通过涂板挑选单克隆菌落重新培养,或者质粒重新转化表达菌株等方法优化菌种.
@卫康6817：蛋白表达不出来怎么办? -
白瑾15654465271…… 这个原因有很多种.你如你的容器或者工具没洗干净,上面沾了油,或者蛋清里混进了蛋黄.还有就是鸡蛋不够新鲜,蛋清很希另外打发的温度过高,或者速度不够都可能出现你说的问题.
@卫康6817：蛋白的大小与诱导表达有无关系?在原核诱导表达中,会不会存在蛋白分子量大导致诱导表达不好进行的情况.是不是分子量小的蛋白容易表达? - 作业帮
白瑾15654465271…… [答案] 太大太小都会导致诱导表达量变小乃至完全不表达的情况(不同的载体有所不同,一般来说15-45KDa的蛋白较好表达获取的量较大,详情要查阅载体的说明).
@卫康6817：构建的原核表达载体,测序也正确,为什么有的就不表达目的蛋白? -
白瑾15654465271…… 先测序看看序列是不是三的倍数,保证是连接到载体上,并且载体也是转入表达菌的,不行的话,通常做法是调节诱导剂浓度,诱导时间,不行就换载体,如BL21换ROSSETTA等,再不行就换载体.其实我也遇到,有个蛋白始终没有表达,没办法放弃了.
@卫康6817：毕赤酵母蛋白不表达是什么原因? -
白瑾15654465271…… 1、 菌株:用GS115表达不出蛋白,换KM71H后,大部分克隆能表达. 2、温度: 在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低. 3、pH:手册上用6.0,pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来.BMMY的pH7.0-7.5比较合适.国内外做的最好的rHSA,最适pH大概5-6左右.pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氢钾调,具体比例自己去试试. siRNA酶: http://product.bio1000.com/116052/ 生物帮上面有这方面的资料.
@卫康6817：pet28a做表达载体,蛋白就是不表达,求助 -
白瑾15654465271…… 蛋白不表达的原因很多,有载体的原因,但肯不定不完全是载体的原因.可以试试不同的表达菌株,诱导浓度,诱导温度,诱导时间等等.
@卫康6817：蛋白质表达一般的条件? -
白瑾15654465271…… 一般影响表达的条件是温度,培养基PH值(一般为7.0),IPTG浓度,转速等,常用条件37度,OD600为0.5-1.0间,IPTG浓度我常用0.1mmOL/L,也可以高到1.5mmol/L.转速需要自己摸索,不要高于200r/min.不同的载体和基因都不同.并没有完全适用的万能条件.
@卫康6817：这个蛋白如何表达? -
白瑾15654465271…… 首先你的蛋白偏小,不容易表达,而且如果你的SDS-PAGE浓度以及电泳时间掌握不好即使表达了也可能看不到.第二,不是什么蛋白都能原核表达,比如跨膜蛋白经常无法表达,看看你的蛋白又没有跨膜区.或者也有可能蛋白不稳定,很容易降解.总之,蛋白表达没有通用的好方法,只有不断模索,比如换载体,换条件等等.你的问题又太笼统,很难判断.
白瑾15654465271…… 第一步:确定载体序列是否正确,启示子、终止子、读码框等; 第二步:确定操作步骤是否正确,如载体是否被污染,是否成功转化入rossetta,抗生素是否正确等; 第三步:核对目的基因序列,...
@卫康6817：为什么用IPTG诱导蛋白没表达? -
白瑾15654465271…… 质粒先测个序吧,这是基础,不然后面一切都白搭.我以前做个C端myc标签的真核表达载体,中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多.可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,表达出了类似大小的带myc标签的蛋白.而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的.
@卫康6817：怎么提高诱导表达的目的蛋白含量 -
白瑾15654465271…… 诱导表达没有目的蛋白产生原因无非两种 一是诱导条件不适合目的蛋白的表达,可通过改变培养基,温度,诱导剂等条件重新摸索出合适的诱导条件. 二是目的蛋白的菌种有问题,可通过涂板挑选单克隆菌落重新培养,或者质粒重新转化表达菌株等方法优化菌种.
@卫康6817：蛋白表达不出来怎么办? -
白瑾15654465271…… 这个原因有很多种.你如你的容器或者工具没洗干净,上面沾了油,或者蛋清里混进了蛋黄.还有就是鸡蛋不够新鲜,蛋清很希另外打发的温度过高,或者速度不够都可能出现你说的问题.
@卫康6817：蛋白的大小与诱导表达有无关系?在原核诱导表达中,会不会存在蛋白分子量大导致诱导表达不好进行的情况.是不是分子量小的蛋白容易表达? - 作业帮
白瑾15654465271…… [答案] 太大太小都会导致诱导表达量变小乃至完全不表达的情况(不同的载体有所不同,一般来说15-45KDa的蛋白较好表达获取的量较大,详情要查阅载体的说明).
@卫康6817：构建的原核表达载体,测序也正确,为什么有的就不表达目的蛋白? -
白瑾15654465271…… 先测序看看序列是不是三的倍数,保证是连接到载体上,并且载体也是转入表达菌的,不行的话,通常做法是调节诱导剂浓度,诱导时间,不行就换载体,如BL21换ROSSETTA等,再不行就换载体.其实我也遇到,有个蛋白始终没有表达,没办法放弃了.
@卫康6817：毕赤酵母蛋白不表达是什么原因? -
白瑾15654465271…… 1、 菌株:用GS115表达不出蛋白,换KM71H后,大部分克隆能表达. 2、温度: 在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低. 3、pH:手册上用6.0,pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来.BMMY的pH7.0-7.5比较合适.国内外做的最好的rHSA,最适pH大概5-6左右.pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氢钾调,具体比例自己去试试. siRNA酶: http://product.bio1000.com/116052/ 生物帮上面有这方面的资料.
@卫康6817：pet28a做表达载体,蛋白就是不表达,求助 -
白瑾15654465271…… 蛋白不表达的原因很多,有载体的原因,但肯不定不完全是载体的原因.可以试试不同的表达菌株,诱导浓度,诱导温度,诱导时间等等.
@卫康6817：蛋白质表达一般的条件? -
白瑾15654465271…… 一般影响表达的条件是温度,培养基PH值(一般为7.0),IPTG浓度,转速等,常用条件37度,OD600为0.5-1.0间,IPTG浓度我常用0.1mmOL/L,也可以高到1.5mmol/L.转速需要自己摸索,不要高于200r/min.不同的载体和基因都不同.并没有完全适用的万能条件.
@卫康6817：这个蛋白如何表达? -
白瑾15654465271…… 首先你的蛋白偏小,不容易表达,而且如果你的SDS-PAGE浓度以及电泳时间掌握不好即使表达了也可能看不到.第二,不是什么蛋白都能原核表达,比如跨膜蛋白经常无法表达,看看你的蛋白又没有跨膜区.或者也有可能蛋白不稳定,很容易降解.总之,蛋白表达没有通用的好方法,只有不断模索,比如换载体,换条件等等.你的问题又太笼统,很难判断.
