gapdh引物序列
@须功2443：这是我设计的罗非鱼GAPDH基因的引物,各位高手看看有没有什么问题啊?最近我跑RT - PCR老失败! -
裴婕13410438488…… 做RT首先确定RNA没有问题,这是前提;然后你这对引物,即使是直接扩增DNA也比较困难,给你俩建议,第一,尽量把突变的碱基放在最5端的位置,你的下游引物突变点有点靠近中间了,不是特别好;第二,把你的引物加长一些或者是设置在GC含量相对高一点的位置以使其退火温度高于60度,这样只要你的RNA没有问题就一定做得出来.你要想用现在的这对引物可以,建议你换好的酶,不然不好做.PP并不是设计引物好的软件,但不知道为什么国内都用它,其实它很业余.
@须功2443：看家基因GApDHmRNA引物是什么东西?有什么用?成分 -
裴婕13410438488…… 有,GAPDH是三磷酸甘油醛脱氢酶,是糖酵解途径中的关键酶.糖酵解途径就是将葡萄糖转化为ATP的过程,负责为生物体提供能量,几乎所有的生物都有该途径.因此GAPDH常常被用来作为内参基因,另外还有β-actin、Ubqutin等由于其广泛存在,也可作为内参基因.
@须功2443：本人做荧光定量PCR,对照基因怎么弄啊,计划对照基因是GAPDH,能帮忙弄个序列么 -
裴婕13410438488…… 人的么? Forward primer AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 20 54.41 55.00% Reverse primer AGGGGCCATCCACAGTCTTC 20 55.59 60.00%
@须功2443：我要做CTGF和BMP - 7的反转录RT - PCR,引物如何设计?内参怎么选择?GAPDH和b - actin哪个能用?谢谢 -
裴婕13410438488…… 可以去影响因子较高的文献里找,然后去pubmed中blast一下就好;也可以用引物设计软件合成,合成原则在网上都可以找到的,合成好了也要blast.两个都是看家基因,均可作为内参,我们实验室用的是GALDH
@须功2443：RT - PCR中内参蛋白GAPDH和b - actin人和小鼠的可以用同一对引物吗? -
裴婕13410438488…… 要回答这个问题必须看你引物的序列.你贴出来我帮你查一下,你自己也可以BLAST一下.如果在人和鼠的基因中都可以BLAST到,则可以用,否则就不可以. 虽然这些House Keeper基因的同源性很高,如果引物不在同源区,还是没办法混用的.
@须功2443：通过rt - pcr怎么计算沉默效率 -
裴婕13410438488…… 缩短暴光时间本来就使带变暗,如果再进一步缩短暴光时间,可能其他的带也不清楚了.还是考虑电泳体系的问题: 1. 首先考虑是你的电压可能有点高,降低电压后适当延长时间可以改善. 2. 2.胶灌的如何,MARKER好象有点变形 3. 3.加样问...
@须功2443：在做RT - PCR时需内参照,怎样获得内参照及其使用? -
裴婕13410438488…… 可以去文献里找,一般GAPDH和bate-actin用的比较多.引物序列就在文献里找即可,文献尽量选影响因子大一些的,找好序列以后在pubmed中核对一下,然后送去公司合成
@须功2443：请给我解释一下RT - PCR的图,谢谢 -
裴婕13410438488…… 你要解释什么?解释表达量差异么?如果是,请自行学习quantity one软件.其实你完全可以考虑用实时定量PCR来做这些实验.现在这种半定量RCP已经基本不能发文章了.顺便说一下,你的GAPDH扩增的不行呀,很多没有主条带.
@须功2443：引物设计在文献上找到引物的序列,但是不知道扩增后是多少bp,所以
裴婕13410438488…… 我很奇怪,你写的序列怎么没有方向呢?哪端是3'端?哪端是5'端?如果开头那个部分是5'端的话,你的一对引物的序列分别为: 5'—gaatgtacgtgccgc—3' 5'—actagctacaatcc—3' 引物的长度一般是15-20个碱基的长度,要按照碱基互补原则进行设计,序列的头部和尾部个一条,一定要注意链的方向~
@须功2443：PCR时小鼠GAPDH扩出条带而目的基因却扩不出是什么原因? -
裴婕13410438488…… 既然其他样本有结果,说明引物没有问题.而该样本GAPDH也有,说明cDNA没有问题.PCR试剂也OK.一个解释,目的基因在这个样本中表达很低.如果是做定量的话建议用real time.这样肉眼看不到的也可以由荧光探测到.
裴婕13410438488…… 做RT首先确定RNA没有问题,这是前提;然后你这对引物,即使是直接扩增DNA也比较困难,给你俩建议,第一,尽量把突变的碱基放在最5端的位置,你的下游引物突变点有点靠近中间了,不是特别好;第二,把你的引物加长一些或者是设置在GC含量相对高一点的位置以使其退火温度高于60度,这样只要你的RNA没有问题就一定做得出来.你要想用现在的这对引物可以,建议你换好的酶,不然不好做.PP并不是设计引物好的软件,但不知道为什么国内都用它,其实它很业余.
@须功2443：看家基因GApDHmRNA引物是什么东西?有什么用?成分 -
裴婕13410438488…… 有,GAPDH是三磷酸甘油醛脱氢酶,是糖酵解途径中的关键酶.糖酵解途径就是将葡萄糖转化为ATP的过程,负责为生物体提供能量,几乎所有的生物都有该途径.因此GAPDH常常被用来作为内参基因,另外还有β-actin、Ubqutin等由于其广泛存在,也可作为内参基因.
@须功2443：本人做荧光定量PCR,对照基因怎么弄啊,计划对照基因是GAPDH,能帮忙弄个序列么 -
裴婕13410438488…… 人的么? Forward primer AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 20 54.41 55.00% Reverse primer AGGGGCCATCCACAGTCTTC 20 55.59 60.00%
@须功2443：我要做CTGF和BMP - 7的反转录RT - PCR,引物如何设计?内参怎么选择?GAPDH和b - actin哪个能用?谢谢 -
裴婕13410438488…… 可以去影响因子较高的文献里找,然后去pubmed中blast一下就好;也可以用引物设计软件合成,合成原则在网上都可以找到的,合成好了也要blast.两个都是看家基因,均可作为内参,我们实验室用的是GALDH
@须功2443：RT - PCR中内参蛋白GAPDH和b - actin人和小鼠的可以用同一对引物吗? -
裴婕13410438488…… 要回答这个问题必须看你引物的序列.你贴出来我帮你查一下,你自己也可以BLAST一下.如果在人和鼠的基因中都可以BLAST到,则可以用,否则就不可以. 虽然这些House Keeper基因的同源性很高,如果引物不在同源区,还是没办法混用的.
@须功2443：通过rt - pcr怎么计算沉默效率 -
裴婕13410438488…… 缩短暴光时间本来就使带变暗,如果再进一步缩短暴光时间,可能其他的带也不清楚了.还是考虑电泳体系的问题: 1. 首先考虑是你的电压可能有点高,降低电压后适当延长时间可以改善. 2. 2.胶灌的如何,MARKER好象有点变形 3. 3.加样问...
@须功2443：在做RT - PCR时需内参照,怎样获得内参照及其使用? -
裴婕13410438488…… 可以去文献里找,一般GAPDH和bate-actin用的比较多.引物序列就在文献里找即可,文献尽量选影响因子大一些的,找好序列以后在pubmed中核对一下,然后送去公司合成
@须功2443：请给我解释一下RT - PCR的图,谢谢 -
裴婕13410438488…… 你要解释什么?解释表达量差异么?如果是,请自行学习quantity one软件.其实你完全可以考虑用实时定量PCR来做这些实验.现在这种半定量RCP已经基本不能发文章了.顺便说一下,你的GAPDH扩增的不行呀,很多没有主条带.
@须功2443：引物设计在文献上找到引物的序列,但是不知道扩增后是多少bp,所以
裴婕13410438488…… 我很奇怪,你写的序列怎么没有方向呢?哪端是3'端?哪端是5'端?如果开头那个部分是5'端的话,你的一对引物的序列分别为: 5'—gaatgtacgtgccgc—3' 5'—actagctacaatcc—3' 引物的长度一般是15-20个碱基的长度,要按照碱基互补原则进行设计,序列的头部和尾部个一条,一定要注意链的方向~
@须功2443：PCR时小鼠GAPDH扩出条带而目的基因却扩不出是什么原因? -
裴婕13410438488…… 既然其他样本有结果,说明引物没有问题.而该样本GAPDH也有,说明cDNA没有问题.PCR试剂也OK.一个解释,目的基因在这个样本中表达很低.如果是做定量的话建议用real time.这样肉眼看不到的也可以由荧光探测到.
