iptg诱导绿色荧光蛋白
@厍轰1000：请教:IPTG的诱导原理是什么 -
燕烁13332508046…… 如果是做蛋白表达的话,冷诱导应该是指的低温诱导吧? 细菌37C生长到一定量,加入IPTG进行诱导表达,正常情况下应该在30C进行诱导表达.但是为了避免表达速度过快形成大量包涵体,所以选择更低温度进行诱导
@厍轰1000：诱导式IPTG的浓度应该好多?要试验确定吗 -
燕烁13332508046…… 一、需要做实验确定,诱导时IPTG的浓度一般情况是1mg/ml,不过有的蛋白有时不需要这么高的浓度. 二、可以做一个梯度诱导,一般在菌浓OD600达到0.8-1.0的时候诱导. 三、培养两个小时候后,每隔一小时取样,大约在3-5小时的时候蛋...
@厍轰1000：pgex - 6p - 1怎样用iptg诱导 -
燕烁13332508046…… 一般是将菌摇到OD600=0.4-0.6,然后加入终浓度1mM的IPTG(这个一般不变,诱导不出来再考虑适当多加点,例如2-5mM),但是诱导时间和诱导温度根据诱导蛋白大孝性质的不同而不同,需要摸索的,你可以做个预实验,隔两个小时取样,最后SDS-PAGE,寻.
@厍轰1000：IPTG诱导后为什么要进行SDS - PAGE检测? -
燕烁13332508046…… IPTG诱导后一般为胞内表达. 1.检验蛋白的表达:取微量菌液,离心收获菌体,然后用PBS 之类重悬,洗涤菌体若干次,加入与菌液等量的PBS,取菌悬液与上样buffer混合,100度3min,取上清上样.对照为未诱导的菌体. 2.蛋白的可溶性鉴定:离心取菌体后,用PBS重悬,超声破碎,分离上清和残片,上清直接制样;残片需再次重悬后,制样上样.观察上清和残片中条带的情况.
@厍轰1000：为什么用IPTG诱导蛋白没表达? -
燕烁13332508046…… 质粒先测个序吧,这是基础,不然后面一切都白搭.我以前做个C端myc标签的真核表达载体,中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多.可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,表达出了类似大小的带myc标签的蛋白.而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的.
@厍轰1000：蛋白用不用IPTG诱导表达量差不多 -
燕烁13332508046…… 不可能的 只有在特定的环境信号(加入IPTG)刺激下,目的基因才会被激活,之后才会产生大量的代谢表达产物,收集有较多表达量的菌体.如果不用IPTG的话,大部分目的蛋白是不会表达的,有少部分可能会有极少量的表达,称之为泄漏表达.所以蛋白用不用IPTG诱导表达量差很多
@厍轰1000：pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - 作业帮
燕烁13332508046…… [答案] 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.
@厍轰1000：BL21中的表达载体为什么要用IPTG诱导 -
燕烁13332508046…… BL21细胞基因组中的T7 promoter可以被IPTG诱导,诱导后其promoter下游基因产物T7 RNA polymerase表达增多,T7 RNA polymerase又可以将转入BL21细胞中的质粒目的基因转录成mRNA,进而表达为蛋白质.因此,IPTG诱导可以使BL21细胞表达更多目的蛋白.
@厍轰1000：基因工程往往以细菌抗药性为目的基因…是对是错?怎么理解
燕烁13332508046…… 错.抗药性基因为标记基因,不是目的基因. 目的基因可以是任何基因,比如胰岛素,比如绿色荧光蛋白,都是可以的.抗性基因为标记基因,用于筛选含有目的基因的载体.
@厍轰1000：基因工程中诱导是怎么回事 -
燕烁13332508046…… 将目的基因或DNA片段导与合适的载体连接转入目标生物细胞,通过IPTG等诱导剂,获得高效可溶性蛋白.
燕烁13332508046…… 如果是做蛋白表达的话,冷诱导应该是指的低温诱导吧? 细菌37C生长到一定量,加入IPTG进行诱导表达,正常情况下应该在30C进行诱导表达.但是为了避免表达速度过快形成大量包涵体,所以选择更低温度进行诱导
@厍轰1000：诱导式IPTG的浓度应该好多?要试验确定吗 -
燕烁13332508046…… 一、需要做实验确定,诱导时IPTG的浓度一般情况是1mg/ml,不过有的蛋白有时不需要这么高的浓度. 二、可以做一个梯度诱导,一般在菌浓OD600达到0.8-1.0的时候诱导. 三、培养两个小时候后,每隔一小时取样,大约在3-5小时的时候蛋...
@厍轰1000：pgex - 6p - 1怎样用iptg诱导 -
燕烁13332508046…… 一般是将菌摇到OD600=0.4-0.6,然后加入终浓度1mM的IPTG(这个一般不变,诱导不出来再考虑适当多加点,例如2-5mM),但是诱导时间和诱导温度根据诱导蛋白大孝性质的不同而不同,需要摸索的,你可以做个预实验,隔两个小时取样,最后SDS-PAGE,寻.
@厍轰1000：IPTG诱导后为什么要进行SDS - PAGE检测? -
燕烁13332508046…… IPTG诱导后一般为胞内表达. 1.检验蛋白的表达:取微量菌液,离心收获菌体,然后用PBS 之类重悬,洗涤菌体若干次,加入与菌液等量的PBS,取菌悬液与上样buffer混合,100度3min,取上清上样.对照为未诱导的菌体. 2.蛋白的可溶性鉴定:离心取菌体后,用PBS重悬,超声破碎,分离上清和残片,上清直接制样;残片需再次重悬后,制样上样.观察上清和残片中条带的情况.
@厍轰1000：为什么用IPTG诱导蛋白没表达? -
燕烁13332508046…… 质粒先测个序吧,这是基础,不然后面一切都白搭.我以前做个C端myc标签的真核表达载体,中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多.可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,表达出了类似大小的带myc标签的蛋白.而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的.
@厍轰1000：蛋白用不用IPTG诱导表达量差不多 -
燕烁13332508046…… 不可能的 只有在特定的环境信号(加入IPTG)刺激下,目的基因才会被激活,之后才会产生大量的代谢表达产物,收集有较多表达量的菌体.如果不用IPTG的话,大部分目的蛋白是不会表达的,有少部分可能会有极少量的表达,称之为泄漏表达.所以蛋白用不用IPTG诱导表达量差很多
@厍轰1000：pet28a是低拷贝质粒,当插入GFP后,会不会影响pet28a - GFP的荧光蛋白强度? - 作业帮
燕烁13332508046…… [答案] 这个主要是看你的GFP蛋白表达量的,和质粒拷贝数多少并没有多大关系.表达量低了,一般是和你的诱导条件有关,你需要优化你的诱导条件.如IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等等.
@厍轰1000：BL21中的表达载体为什么要用IPTG诱导 -
燕烁13332508046…… BL21细胞基因组中的T7 promoter可以被IPTG诱导,诱导后其promoter下游基因产物T7 RNA polymerase表达增多,T7 RNA polymerase又可以将转入BL21细胞中的质粒目的基因转录成mRNA,进而表达为蛋白质.因此,IPTG诱导可以使BL21细胞表达更多目的蛋白.
@厍轰1000：基因工程往往以细菌抗药性为目的基因…是对是错?怎么理解
燕烁13332508046…… 错.抗药性基因为标记基因,不是目的基因. 目的基因可以是任何基因,比如胰岛素,比如绿色荧光蛋白,都是可以的.抗性基因为标记基因,用于筛选含有目的基因的载体.
@厍轰1000：基因工程中诱导是怎么回事 -
燕烁13332508046…… 将目的基因或DNA片段导与合适的载体连接转入目标生物细胞,通过IPTG等诱导剂,获得高效可溶性蛋白.
