蓝白斑筛选对照组怎么设置
@百夜1879：蓝白斑筛选 -
吴贸18485068675…… 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法:是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等.现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146...
@百夜1879：IPTG用来筛选蓝白斑需要搭配什么使用啊,求告知啊,做了几次实验都失败了! -
吴贸18485068675…… 需要搭配X-gal来用,IPTG为安慰型诱导物,可诱导β-半乳糖苷酶的产生,X-gal是β-半乳糖苷酶的作用底物,在β-半乳糖苷酶的作用下X-gal被切割成半乳糖和深蓝色的物质,这样就能看到蓝色,如果lac启动子的质粒中插入了外源基因,则不能产生β-半乳糖苷酶,因此不能分解X-gal产生蓝色底物,所在的菌落呈现白色(相对蓝色),这样就能完美实现蓝白斑的筛选了.根据我们实验的经验IPTG浓度可以控制在50mg/ml;X-gal浓度20mg/ml较好,我们学校做实验是用的武汉双金的,用的很稳定,不过X-gal对光是敏感的,你做好基板之后要尽快的使用.
@百夜1879：有没有高人能告诉我蓝白斑筛的步骤,原理.谢谢. 有加分 -
吴贸18485068675…… 在这之前先说一下做蓝白斑筛选必备条件 (1)首先定义 LacZ:B(beta,打不出来,下同)-半乳糖苷酶 LacZ':含有B-半乳糖苷酶的启动子和5'端的编码的a肽链. 那么LacZ'是没有功能的(是指能表达没有功能的蛋白质),只有和失去正常氨基...
@百夜1879：蓝白斑筛选 -
吴贸18485068675…… α-互补 的原理 载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列.这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能.E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分...
@百夜1879：在PCR反应中,如何设置对照组
吴贸18485068675…… 那要看你做的那种PCR了,如果是为了检测某种DNA或者RNA的话,那你的空白对照,就是在那个空白对照的体系里不加入底物就好了
@百夜1879：关于蓝白斑筛选的遇到的问题 -
吴贸18485068675…… 首先X-gal要避光保存,以免失效;其次培养时间确定够吗?我们前两天做的,也全是白斑,又培养了四个小时,总共20h,就有蓝斑出现了(我用的是大肠杆菌)
@百夜1879：筛选产β - 半乳糖苷酶的菌种 -
吴贸18485068675…… 1.平板筛选培养基:胰蛋白胨15g,蛋白胨5g,K2HPO4 2.5g,酵母浸膏1g,NaCl 5g,琼脂15g,X-gal0.1g,蒸馏水1 000ml,pH 7.0~7.2.2.摇瓶筛选培养基:乳糖1%,胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,K2HPO4 2.5g,酵母浸膏3g,NaCl 5g,蒸馏水1000...
@百夜1879：请问IPTG如何配置?AT克隆蓝白斑筛选用 -
吴贸18485068675…… 直接买现成配置好的得了,买华越洋生物的IPTG溶液,也很便宜.
@百夜1879：Easy - T - vector 与蓝白筛选
吴贸18485068675…… 线性化的T-载体末端多出T,无法自连为环状,你用线性化的T-载体直接转化DH5a,T-载体进入细胞后仍然是线性的,所以质粒无法编码β-半乳糖苷酶N端的146个氨基酸,也就不能形成a-互补,所以形成白斑.但形成的白斑应该很少,因为线性化的质粒导入细胞是比较困难的.这一点是正常的.你的理解也很正确. 为何产品说明书上说可以做蓝白斑筛选呢? 因为我们用T-载体都是同外源基因连接后才导入细胞的,切线性化质粒很难导入细胞,所以几乎可以认为在IPTG-X-gal平板上出现白斑的就是阳性克隆(并非百分百是),所以说明书上也就这么说了.
@百夜1879：蓝白筛选只有白斑 -
吴贸18485068675…… 是的 我也常遇到这样的情况 我猜想你插入的片段是300-1500BP之间 这样大小的片段是最好连接的 所以有很高的重组率 这是正常的 如果你还不放心可以挑一个单菌落 作一下酶切检定
吴贸18485068675…… 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法:是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等.现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146...
@百夜1879：IPTG用来筛选蓝白斑需要搭配什么使用啊,求告知啊,做了几次实验都失败了! -
吴贸18485068675…… 需要搭配X-gal来用,IPTG为安慰型诱导物,可诱导β-半乳糖苷酶的产生,X-gal是β-半乳糖苷酶的作用底物,在β-半乳糖苷酶的作用下X-gal被切割成半乳糖和深蓝色的物质,这样就能看到蓝色,如果lac启动子的质粒中插入了外源基因,则不能产生β-半乳糖苷酶,因此不能分解X-gal产生蓝色底物,所在的菌落呈现白色(相对蓝色),这样就能完美实现蓝白斑的筛选了.根据我们实验的经验IPTG浓度可以控制在50mg/ml;X-gal浓度20mg/ml较好,我们学校做实验是用的武汉双金的,用的很稳定,不过X-gal对光是敏感的,你做好基板之后要尽快的使用.
@百夜1879：有没有高人能告诉我蓝白斑筛的步骤,原理.谢谢. 有加分 -
吴贸18485068675…… 在这之前先说一下做蓝白斑筛选必备条件 (1)首先定义 LacZ:B(beta,打不出来,下同)-半乳糖苷酶 LacZ':含有B-半乳糖苷酶的启动子和5'端的编码的a肽链. 那么LacZ'是没有功能的(是指能表达没有功能的蛋白质),只有和失去正常氨基...
@百夜1879：蓝白斑筛选 -
吴贸18485068675…… α-互补 的原理 载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列.这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能.E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分...
@百夜1879：在PCR反应中,如何设置对照组
吴贸18485068675…… 那要看你做的那种PCR了,如果是为了检测某种DNA或者RNA的话,那你的空白对照,就是在那个空白对照的体系里不加入底物就好了
@百夜1879：关于蓝白斑筛选的遇到的问题 -
吴贸18485068675…… 首先X-gal要避光保存,以免失效;其次培养时间确定够吗?我们前两天做的,也全是白斑,又培养了四个小时,总共20h,就有蓝斑出现了(我用的是大肠杆菌)
@百夜1879：筛选产β - 半乳糖苷酶的菌种 -
吴贸18485068675…… 1.平板筛选培养基:胰蛋白胨15g,蛋白胨5g,K2HPO4 2.5g,酵母浸膏1g,NaCl 5g,琼脂15g,X-gal0.1g,蒸馏水1 000ml,pH 7.0~7.2.2.摇瓶筛选培养基:乳糖1%,胰蛋白胨15g,豆蛋白胨5g,K2HPO4 2.5g,酵母浸膏3g,NaCl 5g,蒸馏水1000...
@百夜1879：请问IPTG如何配置?AT克隆蓝白斑筛选用 -
吴贸18485068675…… 直接买现成配置好的得了,买华越洋生物的IPTG溶液,也很便宜.
@百夜1879：Easy - T - vector 与蓝白筛选
吴贸18485068675…… 线性化的T-载体末端多出T,无法自连为环状,你用线性化的T-载体直接转化DH5a,T-载体进入细胞后仍然是线性的,所以质粒无法编码β-半乳糖苷酶N端的146个氨基酸,也就不能形成a-互补,所以形成白斑.但形成的白斑应该很少,因为线性化的质粒导入细胞是比较困难的.这一点是正常的.你的理解也很正确. 为何产品说明书上说可以做蓝白斑筛选呢? 因为我们用T-载体都是同外源基因连接后才导入细胞的,切线性化质粒很难导入细胞,所以几乎可以认为在IPTG-X-gal平板上出现白斑的就是阳性克隆(并非百分百是),所以说明书上也就这么说了.
@百夜1879：蓝白筛选只有白斑 -
吴贸18485068675…… 是的 我也常遇到这样的情况 我猜想你插入的片段是300-1500BP之间 这样大小的片段是最好连接的 所以有很高的重组率 这是正常的 如果你还不放心可以挑一个单菌落 作一下酶切检定
