βactin内参引物原理
@裘显6731：半定量PCR -
边怕18462922689…… 半定量RT-PCR一般是在没有条件做 实时PCR 的情况下使用,用于测定体内目的基因的表达增加减少与否,即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因(如β-actin)的电泳带的相对含量比较,观测目的基因表达增减,另外还要做一个β-actin的内参照对照. 管家蛋白基因就是细胞内一些表达比较稳定的基因,如β-actin在各种细胞内的含量都稳定在10%左右.因此研究的目的基因的表达量与这些比较恒定含量的基因一比较,就可以观察到目的基因是否随着时间改变了~~~
@裘显6731：什么是内参基因?常用内参基因有哪些?
边怕18462922689…… 这个概念一般是用在定量PCR中.定量PCR是要检测某个基因的表达,降低或者提高,但是当你得出结果以后,你并不知道是它本身的表达降低/提高了,还是你操作过程中造成的误差(比如提RNA时的损失),所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照.这个基因就是内参基因,这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因,表达量几乎不变.常用的内参基因如β-actin,GAPDH,18s-rRNA等
@裘显6731：半定量RT -
边怕18462922689…… 以-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术,较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行. 这种方法不另设'内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性. 步...
@裘显6731：做RT与Western能 用同一个β - actin吗?
边怕18462922689…… RT是核酸水平,western是蛋白水平;一个用actin引物,一个用actin抗体,如何用同一个actin?不太明白
@裘显6731：酵母菌actin内参序列 -
边怕18462922689…… 可以啊,β-actin是一种持家蛋白,当然可以用作qPCR内参.
@裘显6731：反向PCR怎么做 -
边怕18462922689…… 反向pcr(inverse pcr)反向pcr是一种多聚合酶链式反应(pcr)应用的方法,可使已知序列的核心区边侧的未知rma成几何级数扩增.用适当的限制性内切裂解含核心区的rma,以产生适合于pcr扩增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子.pcr的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区.这种反向pcr方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序.
@裘显6731：我做RT - PCR要用Marker和β - actin吗? -
边怕18462922689…… 需要Maker的,不然你不知道你扩出来的条带是不是你需要的.另外内参(actin 是在生物发育的每个阶段都会表达,应该就是一个管家基因靶,所以可以拿出来当内参的)也是需要的,这样可以对你跑出来的目的基因和内参做一下比较,做一下半定量.
@裘显6731：RT - PCR的RNA如何定量 -
边怕18462922689…… 设计内参引物,一般来说,是actin基因先确定循环数:设置不通的循环数,用反转录cDNA为模板进行PCR扩增,以能扩出来条带为循环数均一化模板:不同体积的cDNA为模板,以确定的循环数为扩增循环数,进行PCR扩增,调节模板的量到扩增亮度一致时,cDNA的量就一样了然后,再用你自己的引物进行扩增,就可以得到理想结果了
@裘显6731：实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? -
边怕18462922689…… 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
@裘显6731：做RT - PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因 -
边怕18462922689…… 内参就是在cDNA里面的啊 比如你有三种反转录的cDNA 就分别用内参的引物做三组 和目标基因一起做就行了 不过是要单独加 不是和目标基因的引物加在一个孔里
边怕18462922689…… 半定量RT-PCR一般是在没有条件做 实时PCR 的情况下使用,用于测定体内目的基因的表达增加减少与否,即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因(如β-actin)的电泳带的相对含量比较,观测目的基因表达增减,另外还要做一个β-actin的内参照对照. 管家蛋白基因就是细胞内一些表达比较稳定的基因,如β-actin在各种细胞内的含量都稳定在10%左右.因此研究的目的基因的表达量与这些比较恒定含量的基因一比较,就可以观察到目的基因是否随着时间改变了~~~
@裘显6731：什么是内参基因?常用内参基因有哪些?
边怕18462922689…… 这个概念一般是用在定量PCR中.定量PCR是要检测某个基因的表达,降低或者提高,但是当你得出结果以后,你并不知道是它本身的表达降低/提高了,还是你操作过程中造成的误差(比如提RNA时的损失),所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照.这个基因就是内参基因,这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因,表达量几乎不变.常用的内参基因如β-actin,GAPDH,18s-rRNA等
@裘显6731：半定量RT -
边怕18462922689…… 以-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术,较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行. 这种方法不另设'内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性. 步...
@裘显6731：做RT与Western能 用同一个β - actin吗?
边怕18462922689…… RT是核酸水平,western是蛋白水平;一个用actin引物,一个用actin抗体,如何用同一个actin?不太明白
@裘显6731：酵母菌actin内参序列 -
边怕18462922689…… 可以啊,β-actin是一种持家蛋白,当然可以用作qPCR内参.
@裘显6731：反向PCR怎么做 -
边怕18462922689…… 反向pcr(inverse pcr)反向pcr是一种多聚合酶链式反应(pcr)应用的方法,可使已知序列的核心区边侧的未知rma成几何级数扩增.用适当的限制性内切裂解含核心区的rma,以产生适合于pcr扩增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子.pcr的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区.这种反向pcr方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序.
@裘显6731：我做RT - PCR要用Marker和β - actin吗? -
边怕18462922689…… 需要Maker的,不然你不知道你扩出来的条带是不是你需要的.另外内参(actin 是在生物发育的每个阶段都会表达,应该就是一个管家基因靶,所以可以拿出来当内参的)也是需要的,这样可以对你跑出来的目的基因和内参做一下比较,做一下半定量.
@裘显6731：RT - PCR的RNA如何定量 -
边怕18462922689…… 设计内参引物,一般来说,是actin基因先确定循环数:设置不通的循环数,用反转录cDNA为模板进行PCR扩增,以能扩出来条带为循环数均一化模板:不同体积的cDNA为模板,以确定的循环数为扩增循环数,进行PCR扩增,调节模板的量到扩增亮度一致时,cDNA的量就一样了然后,再用你自己的引物进行扩增,就可以得到理想结果了
@裘显6731：实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? -
边怕18462922689…… 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
@裘显6731：做RT - PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因 -
边怕18462922689…… 内参就是在cDNA里面的啊 比如你有三种反转录的cDNA 就分别用内参的引物做三组 和目标基因一起做就行了 不过是要单独加 不是和目标基因的引物加在一个孔里
